摘 要：抗生素在畜牧业中广泛应用，不可避免地造成牛奶中残留抗生素。抗生素残留不仅危害人类健康，同时也影响牛奶的品质，造成经济损失。本文就牛奶中抗生素残留的来源和危害以及牛奶中抗生素残留的检测方法作一综述。
关键词：牛奶；抗生素残留；微生物法；高效液相色谱法；色/质联用法；免疫法
随着抗生素在乳畜饲养业中的广泛应用，牛奶中抗生素残留问题日趋受到国际社会的重视。对此，检测技术也迅速发展，以寻求简便、快速、准确、敏感性高的检测方法满足日趋严格的残留限量的要求，保障人们饮用牛奶的卫生和安全。
1 牛奶中抗生素残留的来源及其危害
1.1 牛奶中抗生素残留的来源
一般认为，对泌乳牛用药不当或不注意安全时间是牛乳中抗生素残留的重要因素，尤其是使用乳房灌注法治疗乳腺炎时，易造成牛乳中抗生素残留。随着畜牧业的发展，在牛饲料中添加饲料添加剂已十分广泛，其中含量有一定比例的抗生素，主要作用是预防疾病的发生，这也是牛乳抗生素残留重要原因。此外，在高温季节，一些不法交奶户为防止乳的酸败，往往向牛乳中掺杂各种抗生素，这也是乳中抗生素残留的一个来源。1983年，Egan[1]调查表明，重用经抗生素治疗的乳牛用过的挤乳器给正常乳牛挤乳，可使正常牛的乳中残留抗生素，于是他指出：挤乳是乳中抗生素残留的另一个来源。
1.2牛奶中抗生素残留的危害
牛奶是老少皆宜的营养品，牛奶中若含有抗生素，对长期饮用者来说无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，对抗生素有过敏体质的人服用残留抗生素的乳后会发生过敏反应。即使是正常饮用者，体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患者再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素是奶牛场治疗乳房炎的常规药物。由于长期大量使用抗生素，使耐药菌株增加，一些乳房炎病例变得难以用常规方法治愈。 这又促使临诊兽医在治疗过程中加大抗生素的用量。此外，牛奶中抗生素残留会影响奶制品的品质，如果用含抗生素的奶做酸奶或乳酪等，则残留在其中的抗生素会抑制细菌的发酵，使产量和质量降低。因此市场不允许出售抗生素残留过量的牛奶，这样也造成牛奶生产者的经济损失。
2 牛奶中的抗生素残留检测方法研究进展
2.1微生物检测法
微生物检测法是应用较广泛的方法，如纸片法、 TTC法等等，因其测定原理基于抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，因而与临床应用的要求一致，但其测定时间长且结果误差较大。目前趋向灵敏、准确、简便、快速的微生物检测方法研究，如酶标抗体检测法等。
2.1.1纸片法
纸片法，即PD法(Paper Disc)。常用的纸片法有枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片检测法。这两种方法主要用来检测牛奶中的β-内酰胺类抗生素，其操作过程基本相同，而选用的菌种不同。枯草杆菌纸片法检测的结果易出现假阳性，为了确定阳性物质是否为青霉素(或β-内酰胺类)，对加热后的乳样用青霉素酶处理，以灭活乳样中的青霉素。然后再行检测，检测限可达0.01IU/mL。而嗜热脂肪杆菌纸片检测法不仅用于检测奶样中β-内酰胺类抗生素，并能暗示是还存在其他抑菌物质，检测限可达0.008IU/mL以下。一般在4h内即可获得有关乳中是还存在β-内酰胺抗生素残留的结果。因此，在实践中，嗜热脂肪杆菌纸片法在奶样的检测中比枯草杆菌纸片法应用更为广泛。1991年，神保胜彦对纸片法作了进一步研究和改进。改进后的方法不仅能够确定抗生素的种类，而且提高了检出率和准确率，对氯霉素最低检出量0.01ppm，土霉素0.05ppm，链霉素1ppm，红霉素0.05ppm，青霉素0.0025ppm。
2.1.2 TTC法
TTC法，即氯化三苯基四氮唑法( tripheye tetrazolium chloride)，这是目前我国食品卫生标淮中规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法(GB5409?85)。如果牛乳中有抗生素存在，当乳中加入菌种(嗜热链球菌)经培养后，菌种不增殖，此时加入的TTC指示剂不发生还原反应，所以仍呈无色状态；如果没有抗生素存在，则加入菌种即行增殖，TTC还原变成红色，使样品染成红色，即牛乳的颜色不变为阳性，染成红色为阴性。检测各种抗生素的灵敏度(最低检出量)：青霉素0.004 U/ml，链霉素0.5 U/ml，庆大霉素0.4 U/ml，卡那霉素5 U/ml。
一些文献报道了我国标TTC法测定的我国部分地区市售牛乳中抗生素残留的情况。1988年，周树南[6] 对江苏省8市10个牧场生奶、消毒牛奶和奶粉中抗生素残留情况进行调查，结果发现生奶阳性率3.6%，消毒牛奶11.4%，奶粉39.58%。李权超[7]1991、王晓光[8]1992年测得长春市市售鲜牛奶中抗生素残留阳性率3.3%，可疑率18.3%和2.5%。安增海1997年、张利琴[9]1999年、常建军[10]2000年测得西宁市市售鲜奶中抗生素阳性率分别为2%、11.7%和5.3%。 葛华等[11](1996)对西宁市各类奶样进行调查，共采集奶样187份(奶牛场生奶110份、牛奶公司袋装消毒奶35份、私人沿街售奶42份)，检出有抗生素残留奶8份，阳性率4.3%。
2.2理化检测法
理化检测方法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法、气相色谱法、比色法、荧光分光光度法等等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高，但有的检测程序较复杂，有的检测费用较高。而牛奶中抗生素残留检测最为常用的理化检测方法是高效液相色谱和联用技术。
2.2.1高效液相色谱
高效液相色谱是目前广泛应用的一种理化检测方法，它引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵，高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分离速度快、效率高和操作自动化。高效液相色谱法测定牛奶中的药物残留都要经历样品处理(包括样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤)、残留药物的分离和残留药物的检测。
样品的提取一般使用水和酸化有机溶剂，两者可以同时达到脱蛋白和萃取残留的目的。加拿大HAL使用钨酸钠、硫酸和水从组织中提取青霉素并脱掉蛋白质[5]。这种方法对牛奶中的青霉素效果非常好。样品经提取后要进行蛋白质沉淀。脱蛋白的常用有机溶剂有甲醇[6，7]、乙腈[8]和2-丙醇[9]；无机酸有硫酸和钨酸钠[10,11]，酸化乙腈(Ph4.0～4.4)[12]，以及超滤法[13,14]等。Bioson等[15]通过把青霉素萃取入水相中，在硫酸和钨酸钠的存在下，已能减少几种非极性化合物的污染，得到比较干净的水提取液。为了从生物体液和动物组织中提取青霉素残留，Barker等[10]提出了基体固相分散技术(MSPD)，即把样品基体与固相填料(如C18填料)混合搅拌均匀，然后把搅拌均匀的物质填充到层析柱中，用适当的溶剂淋洗上层分析物。
通常，得到的水提取液或有机提取液中，目标分析物浓度都有很低，还含有许多共萃物，如果这些物质在最终的溶液中存在，不仅会损害色谱仪器，也会增加检测的噪音，无法测定痕量浓度的目标分析物。为了降低背景化合物的干扰，通常需要对目标分析物进行净化与浓缩。常用的净化和浓缩方法有离子交换(IE)、固相萃取(SPE)和免疫亲合色谱法(IAC)。Moats等[16]在分析青霉素残留时,首次尝试验把自动在线痕量富集的方法用于样品净化。这种半自动化技术使用馏分收集器收集色谱淋洗液中预先确定的馏分。把收集到的馏分浓缩后，再进行液相色谱测定。此法已用于测定牛奶中的羟氨苄青霉素[16]，邻氯青霉素和苯氧甲基青霉素[17]、氨苄青霉素和羟氨苄青霉素[18]。
残留组分的分离方式包括正相、反相和离子交换等几种分离手段。近几年来大都有改用反相色谱法[19]，最常用的分析柱填料为ODS-C18。反相HPLC具有高效、短时，并在含水系统中完成分析等特点。某些含有立体异构体的药物，如氨苄青霉素、苯氧乙基青霉素以及羧苄青霉素等，也可用离子对反相(RP)HPLC来改善其分离效果[20]。但对强极性的青霉素类药物，如头孢三嗪，分离效果不甚理想。在流动相中加入离子对试剂，以改善其分离的选择性。
青霉素药物被分离后，最常用的检测方式为浓度型的紫外检测器和荧光检测器。彭莉等[21]报道了用高效液相色谱法(HPLC)检测牛奶中氯霉素的残留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中残留的氯霉素，用正烷-氯仿(1+1，V/V)溶解残渣，以乙腈-0.005mol/L磷酸氢二铵(18+82，V/V)作为流动相，用高效液相色谱仪紫外检测器在278nm检测。平均加收率94.8%，变异系数<12.0%。样品前处理简单、回收率高、实用性强、检疫灵敏度高、重现性好、检测数据准确可靠，可作为牛奶中氯霉素残留检测的确证方法。 由于奶样中药物残留量少，背景干扰往往很严重，因此一般都使用柱前或柱后衍生技术，通过柱前衍生反应可以有效地提高紫外检测器检测残留的灵敏度。目前，随着接口技术的显著改进，质谱作为一种质量流速型检测器，正广泛应用于残留分析的检测中。电化学检测器也已用于检测邻氯青霉素[22]、头孢菌素[23，24]和青霉素[25]。
由于其固有的高灵敏度，荧光检测法在多数LC分析中要优于紫外检测法。Terada[26]利用氨苄青霉素在甲醛和三氯乙酸溶液中形成 能产生荧光的衍生产物的原理，用荧光检测器，测定牛奶中氨苄青霉素残留量。这不仅提高了方法的选择性，而且灵敏度可达1μg/L。此外还有用dansylaziridine[27]、9-芴基甲基氯甲酸酯[28]和4-溴甲基-7甲氧香豆素[29]为用衍生化试剂的报道，但由于受到多种因素的限制，应用并不多。尽管测定原理不同，但样品的前处理步骤并没有多大区别，都要经历样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤，而所选用色谱柱均为反相柱，流动相为有机溶剂和磷酸盐缓冲液。总之，液相色谱法测定牛奶药物中药物残留的方法正逐渐成熟起来。
2.2.2色/质联用法
色/质联用法由于实现了高效层析分离和检测联机，可用微电脑控制层析条件、程序和数据处理，其特异性、灵敏度和重复性均好，并可一次同时完成同一样本中多种药物及其代谢物检测。对分析牛奶中青霉素类抗生素，质谱作为一种专一检测器已获得广泛应用。其分析方式有直接探头分析法、直接液体导入法、GC/MS、LC/MS联用法等。使用电子轰击离子化、化学电离、快速原子轰击、热喷雾电离、等离子体喷雾、粒子束电离、大气压化学电离(APCI)和电喷雾电离(ESI)技术对不同MS离子源条件下青霉素类药物分子碎片类型的特征已经作了大量的工作。另外离子阱质谱技术(MS/MS)也已用于鉴别青霉素类药物。
1991年，Tyczkowska等[30]曾用热喷质谱技术鉴别了牛奶中的青霉素G。该方法使用苯氧甲基青霉素作内标，牛奶样品用钨酸钠沉淀蛋白后，上清液用Bond Elut C18SPE固相柱净化，用乙腈-0.0125mol/L醋酸胺(60+40)洗脱青霉素。洗脱液直接用TSP/MS测定。 测定低限为0.005mg/kg。Bioson[37,32]使用TSP/LC/MS对牛奶和动物组织中残留的青霉素进行测定和确证。后来又使用连接紫外检测器的LC/TSP/MS确证了牛奶中的青霉素G。
随着电喷雾接口技术的成熟，LC/ESI/MS技术已广泛用于测定牛奶中的青霉素类抗生素。由于采用选择离子检测方式，故不仅提高了该测定方法的灵敏度，同时也使得方法的选择性得到很大改善。Straub等[33]使用LC/ES/MS测定了牛奶中的几种青霉素残留。青霉素，邻氯青霉素与苄青霉素的最低测定限为3∽5礸/kg，氨苄青霉素与羟氨青霉素的最低测定限为20∽30礸/ml。
随着离子阱技术中色/质联用法中的应用，Heller等[34]使用电喷雾离子化串联离子阱质谱技术测定了牛奶中7种青霉素类抗生素残留。该法可检测牛奶中低至5μg/L(苄青霉素)与10μg/L( 头孢噻呋、头孢匹林、头孢唑啉、氨苄青霉素、羟氨青霉素和邻氯青霉素)水平的七种青霉素类抗生素残留。这种检测技术尽管灵敏度很高，得到的结构信息也比较多。由于影响因素比较复杂，结果的重现性并不理想，再加上离子肼的空间较少，更易受到样品基体的干扰，所以这种技术用于牛奶中抗生素残留的检测还需做深入的研究工作。此外，张素霞等[35]报道了用MSPD-HPLC-UV分析法检测牛奶中四环素类药物残留。样品平均回收率为78.7%∽90.2%，变异系数在2.4%～18.8%之间，方法检测限为0.02礸/ml∽0.05礸/ml。 Kihak 等[36]以NCI方式的LC/PB/MS技术成功对牛奶中OTC、TC与CTC残留进行确证。Fenneell等[37]使用反相HPLC/PDA测定了牛奶中及肉制品中的庆大霉素组分, 检测限为0.5礸/ml。
2.2.3其它理化检测方法
宋华宾等[38]依据抗生素的一些特殊呈色反应检测牛乳中的氯霉素、四环素、土霉素、链霉素、红霉素和庆大霉素，方法简便、快速，并且能半定量。另外，利用抗生素对牛乳变酸的抑制作用进行抗生素残留检测，当酸牛乳培养物加入后，用溴甲酚紫指示剂检测其酸性变化，并据此作出判断，此法检出量:青霉素0.00001IU／m1，链霉案5ppm。
2.3免疫法
目前药物残留免疫分析技术主要分为两大类：一为相对独立的分析方法，即免疫测定法(immunoassays，IAs)，如RIA、ELISA、固相免疫传感器(soindphase immunosensor )等；二是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免疫分析的高选择性作为理化测定技术中的净化手段，典型的方式为免疫亲合色谱(immunoaffinity chromatogrphy,IAC)。
抗生素残留监测中的免疫测定法 只能作为筛选方法,其定量效果还有待进一步研究。如Watanabe等[39]确制备了卡那霉素结合抗原，并筛选单克隆抗体，用直接竞争ELISA法测定牛奶样品，检测限为4ng/ml。此外，还设计了测定试纸：载体为硝酸纤维薄膜，标记物为卡那霉素-HRP，底物为5-溴-4-4氯-3吲哚磷酸二钠，检测限达50ng/ml。Schnappinger等[40，41]建立了牛奶中链霉素和双氢链霉素的直接竞争ELIS，样品经离心胶脂(4000g,20min)和PBS稀释后直接测定，检测限分别为0.6ng/ml和0.4ng/ml。Haasnoot等[42]报道了牛奶中链霉素、双氢链霉素、庆大霉素和新霉素直接竞争ELISA测定法，检测限达10∽15ng/ml。
1966年，Hamburger[43]首次制备发抗氯霉素抗体。目前建立的各种免疫分析方法都是针对所在氯霉素生直接采用琥珀氯霉素作为免疫半抗原制备结合抗原。抗体对氯霉素琥珀氯霉素的交叉反应分别为100%、853%和0.43%，对其他常见的32种抗微生物药物(包括β-内酰胺、四环素类、氯基糖苷类、大环内酯类、多肽在、磺胺类和硝基呋喃类)的交叉反应都有低于0.01%。1984年，Arnold等[44]建立了氯霉素的放射免疫测定法(RIA)，并与GC/ECD进行了比较，检测限为0.2礸/?。
Van de Water等[45，46]报道了牛奶中氯霉素的免疫亲合色谱(IAC)净化法，样品经离心、过滤和稀释(固体样品首先用水提取)后用IAC柱净化，HPLC/UVD测定，回收率70%～99%。牛奶样品的检测限最低可达20ng/L(由于IAC的高度选择性方法检测限将主要决定于取样量)。通过柱切系统，Haagsma等[47] 还进一步建立了牛奶中氯霉素的在线亲和色谱/HPLC/UVD测定法，能直接分析液体样品或提取液。
Huth[48]用荧光免疫法测定牛奶中的6种β-内酰胺类抗生素，检测分析系统组成：一个内含4个毛细管的测定管、一个带有4个用来干燥试剂的的凹面的试剂盘和一个毛细管反应器。反应在毛细管反应器内进行，并通过毛细管反应器识别荧光显示结果，然后输出测定结果。牛奶中β-内酰胺类抗生素的最低检测限为：青霉素G,3.2 ppb、, 氨苄青霉素2.9 ppb 、羟氨苄青霉素,3.6 ppb 、邻氯青霉素,7.4 ppb 、头孢匹林,16.3 ppb 、头孢噻呋33.7 ppb。
综上所述，鉴于牛奶中抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题，应重视和加强检测工作，并且努力研究发展一些简单、快速和便携化的筛选性多残留分析技术；发展高效、高灵敏的联用技术和多残留组分确证技术，如LC?MS、CZE?MS；分析过程自动化或智能化，以提高分析效率、降低成本，保证消费者的健康。
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Antibiotic residues and the development of its detections in milk
Deng Bin Zhang Xi
(yunnan Animal and Feed Laboratory, kunming 650201)
Abstract: antibiotics,have been widely applied in livestock farming,were inevitably residued in milk.It not only lowers the quality of milk,but also has bad effect on human health. It is summed up the resoure and disadvantage of antibiotics residues in milk in the paper,as well as its detections.
Keyword:milk; antibiotic residues; mirocroble meoths; liquid chromatography ; LC/MS; immunoassays
