免疫组化DAB法 显示过氧化物酶

免疫组化DAB显示过氧化物酶
原理〕 过氧化物酶分解H2O2的过程中,下面反应不直接发生:AH2(供氢体)+H2O2→A(供氢体的氧化物)+2H2O2实验可知,有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物(受氢体)复合体生成,在复合体最后分解为酶和水时,游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质,如奈酚和联苯胺。
免疫组化染色步骤(以ABC法为例)
溶液的配置:
1. 0.1M 2000ml:NaCL 18g, NaH2PO4·2H2O 0.8g, Na2HPO4·12H2O 12g. 共六份
2. 柠檬酸盐缓冲液:
贮存液:0.1M柠檬酸溶液(A):21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水
0.1M柠檬酸三钠溶液(B):29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水
工作液:9ml A液+41ml B液+450ml 蒸馏水→0.01M柠檬酸盐缓冲液
3. 0.03% H2O2-甲醇:30% H2O2 0.4ml + 400ml 纯甲醇→充分混匀
4. 20% 甘油:80ml 纯甘油 + 320ml 蒸馏水
5. 稀释抗体:1︰300 ,1︰400 ,1︰600 (临用前配)
6. 酒精的配置
染色步骤:一步法
1. 载玻片 烤箱中 6040′。
2. 二甲苯Ⅰ,6020′(水浴箱中),二甲苯Ⅱ,室温 15′。
3. 脱水,100%→95%→85%→75%酒精,每级均为3′。
4. 蒸馏水冲洗, 5′﹡1
5. 微波炉修复抗原:0.01M 柠檬酸盐缓冲液,99℃ 肺 20′,心肾 12
6. 3′*3
7. 0.03% H2O2-甲醇,室温20
8. 冲洗, 3′*3,甩干或纸巾吸去多余液体(勿碰到组织),PAP Pen划境线。
9. block solution 封闭抗原,室温10′。
10. 倾出封闭液,不洗,滴加一抗(60ul),4℃过夜或37℃ 1~2h。
11. 冲洗,3′*3。
12. 除去,滴加A增强剂,室温25′。
13. 冲洗,3′*3。
14. 除去,滴加B剂,室温35′。
15. 冲洗,3′*3。同时配置DAB显色剂。
16. 除去,DAB显色10′(在显微镜下观察染色程度控制染色时间)。蒸馏水冲洗。
17. 复染:苏目素均匀滴加2滴,40′′,蒸馏水冲洗,60℃温水泡半分钟。
18. 脱水:75%酒精→85%→95%→100%(3次),每级3′。
19. 透明:二甲苯Ⅰ3′,二甲苯Ⅱ3′。
18. 封片:中性树脂,加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡),60℃ 0.5h烘干。
结果:棕褐色反应产物代表抗原X的定位。
拍照
1. 更换样品时,除了调整焦距和视野外,显微镜上的其他部件都不能动!所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中,不要一会用高倍镜,一会用低倍镜,来回切换物镜。
2. 数码相机必须设置为手动曝光,并且保持每张照片用同样的曝光条件,同样的曝光时间,同样的光圈。特别要注意的是,一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉
3. 免疫组化切片一般染色不太深,因此拍摄出的照片颜色较浅,就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色,一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄,也不偏蓝。

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发布人:众宇旺仪器 发布时间:2012年1月5日 已被浏览 1149 次 〖 打印本文